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1.信號弱
| 可能原因 | 解決方法 |
| 試劑盒沒有充分平衡 | 試劑室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫 |
| 孔內(nèi)注入底物量不足 | 檢查吸液槍的功能，必要時進(jìn)行校準(zhǔn)。確保槍頭與槍緊密地結(jié)合。使用同樣的方法反復(fù)分析 |
| 孵育的時間或者溫度不夠 | 校正溫育箱溫度，避免在周圍環(huán)境條件變化大的區(qū)域（如：在通風(fēng)口或窗邊處）孵育酶標(biāo)板 |
| 配制緩沖液的蒸餾水有問題 | 使用新鮮合格的蒸餾水 |
| 對照設(shè)置不當(dāng) | 按照試劑盒的推薦，確保設(shè)置與對照孔的正確使用 |
| 酶標(biāo)儀濾光片不正確 | 檢查酶標(biāo)儀使用的濾光片，如用TMB顯色，應(yīng)選用450nm的濾光片 |
| 顯色反應(yīng)時間太短 | 延長顯色時間 |
| 不正確的試劑儲存方式 | 按照說明書要求保存試劑盒 |
| 試劑混用 | 不同批號試劑勿混用，如有必要請咨詢生廠商 |
2.重復(fù)性差
| 可能原因 | 解決辦法 |
| 洗板不徹底 | 確保洗板儀正常工作。不要減少洗液量、洗板次數(shù)或浸泡時間 |
| 污染 | 因唾液或皮膚可能含有分析物，因此在實驗過程中，要帶上口罩和手套 |
| 加樣本及試劑量不準(zhǔn)，加樣本及試劑量不準(zhǔn)孔間不一致 | 重復(fù)某一樣品時，加樣時間盡可能與第一次接近； 重復(fù)測定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致 |
| 孔內(nèi)試劑未充分混合 | 不要使孔過于干燥。確保孔內(nèi)試劑混合充分 |
| 加入孔內(nèi)的試劑量不等 | 檢查吸液管（槍）的功能，必要時進(jìn)行校準(zhǔn) |
| 加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區(qū) | 加樣槍頭不要貼壁 |
| 重復(fù)利用槍頭或者試劑容器 | 在每次加標(biāo)準(zhǔn)品、樣品或試劑之前，應(yīng)更換槍頭。每次配試劑時應(yīng)更換新的容器 |
| 重復(fù)利用酶標(biāo)板封板膜 | 在每次孵育階段，按試劑盒內(nèi)推薦，使用新的封板膜 |
3.數(shù)據(jù)降低
| 可能原因 | 解決辦法 |
| 不恰當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)處理方法 | 按照試劑盒內(nèi)的推薦，使用數(shù)據(jù)處理方法。其他處理方法可能會降低標(biāo)準(zhǔn)曲線的精確度。 |
| 標(biāo)準(zhǔn)曲線未經(jīng)分析 | 如果沒有計算機(jī)軟件，使用對數(shù)紙繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并對對數(shù)變化進(jìn)行回歸分析。另外的標(biāo)準(zhǔn)曲線必須與每次分析相符合。試劑盒內(nèi)所提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供參考，并不能用于計算結(jié)果。 |
| 樣本稀釋 | 做好預(yù)實驗，選擇好合適的稀釋比例，盡量使樣本濃度處在最佳的檢測范圍 |
| Hook效應(yīng) | 樣本濃度如果遠(yuǎn)高于試劑盒的檢測范圍，而樣本沒有稀釋到合理的范圍，會導(dǎo)致hook效應(yīng)，致使結(jié)果呈現(xiàn)假陰性 |
4.高背景/非特異性染色
| 結(jié)果描述 | 可能的原因 | 解決方法 |
| 終止后，整板結(jié)果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色；或標(biāo)曲有線性但背景過高 | 整板發(fā)黃現(xiàn)象可能由于錯加其他試劑造成 | 實驗前檢查試劑的組分及批號，確認(rèn)所有組分均屬于對應(yīng)的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。 |
| 未充分清洗酶標(biāo)板 | 確保清洗過程中每個微孔所加入洗滌液量一致。清洗完成后，將酶標(biāo)板用力按壓在吸水紙上，以除去殘余的緩沖液。 | |
| 孵育時間過長 | 嚴(yán)格按照說明書操作。 | |
| 酶標(biāo)記物污染了吸頭及盛放顯色劑容器或陽性對照污染了微孔 | 吸取不同的試劑時應(yīng)更換吸頭，配置不同的試劑組分時，應(yīng)使用不同的儲液器皿。操作時請使用移液器。 | |
| 檢測抗體或Avidin-HRP的濃度過高 | 檢查濃度計算是否正確或進(jìn)一步稀釋后再使用。 | |
| 底物在使用前曝光或污染 | 加入底物前，應(yīng)始終避光保存。 | |
| 顯色時間過長 | 延長顯色時間 | |
| 讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片 | TMB為底物時應(yīng)在450nm波長讀取吸光值，并以650nm作為校正波長。 |
5.白板
| 結(jié)果描述 | 可能的原因 | 解決方法 |
| 顯色步驟結(jié)束后，酶標(biāo)板所有孔均無顏色。陽性對照不顯色 | 組分試劑混淆使用 | 配制或使用時應(yīng)看清楚標(biāo)簽。 |
| 洗板及加樣過程中，酶標(biāo)物受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力 | 確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑（如NaN3等），確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈。 | |
| 遺漏了某種試劑或某個步驟 | 詳細(xì)審閱說明書，并嚴(yán)格遵循操作步驟。 |
6.顯色淡
| 結(jié)果描述 | 可能的原因 | 解決方法 |
| 包括標(biāo)曲、樣本在內(nèi)的所有板孔顏色均較淡。 | 試劑盒超過有效期或儲存不當(dāng) | 請在有效期內(nèi)使用，并按照說明書推薦的保存條件保存，避免污染。 |
| 試劑、樣品用前未平衡 | 所有試劑、樣品應(yīng)置室溫平衡 30min左右。 | |
| 移液器吸量不足，移液抽吸排放太快，吸頭內(nèi)壁掛液太多或內(nèi)壁不清潔 | 校正移液器，吸頭要配套，每次吸頭要吻合緊密。移液不宜過快，排放應(yīng)完全。吸頭內(nèi)壁要清潔，最好一次性使用。 | |
| 孵育反應(yīng)時間不足 | 定時器準(zhǔn)確定時 | |
| 顯色反應(yīng)時間不足 | 一般在15-30min，20min為佳，特殊除外。 | |
| 顯色劑加入順序顛倒（雙組分） | 請嚴(yán)格按說明書。 | |
| 洗滌次數(shù)增加，濃縮洗液稀釋倍數(shù)不符合要求 | 配制好的洗液一定要檢測PH值是否呈中性。 | |
| 蒸餾水水質(zhì)有問題 | TMB為底物時應(yīng)在450nm波長讀取吸光值，并以650nm作為校正波長。 | |
| 洗板及加樣過程中，酶標(biāo)物受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力 | 確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑（如NaN3等），確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈，確認(rèn)配制洗液的純化水達(dá)到要求且未受污染。 | |
| 標(biāo)曲正常，樣本顯色較淡 | 樣本使用NaN3防腐，抑制了酶的反應(yīng) | 樣本不可使用NaN3。 |
| 待測標(biāo)本中可能不含強(qiáng)陽性標(biāo)本，故結(jié)果可能是正常的 | 如有懷疑，可復(fù)檢。 | |
| 目測結(jié)果正常，但酶標(biāo)儀讀值偏低 | 讀取吸光值時使用了錯誤的濾光片 | TMB為底物時應(yīng)在450nm波長讀取吸光值，并以650nm作為校正波長。 |
7.標(biāo)準(zhǔn)曲線不佳/重復(fù)性不好
| 結(jié)果描述 | 可能的原因 | 解決方法 |
| 重復(fù)性差 | 標(biāo)準(zhǔn)品配制有誤 | 嚴(yán)格按照說明書標(biāo)準(zhǔn)品配制進(jìn)行操作。僅使用推薦的稀釋液對標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行稀釋。 |
| 試劑盒儲存方法不當(dāng)或儲存環(huán)境太差 | 請在說明書推薦的保存條件下保存，不要將重懸后的組分在室溫放置時間過長。 | |
| 過早稀釋各工作組分 | 各工作組分請在使用前10分鐘配制，并立即加入到微孔中。 | |
| 樣本加入后未混勻 | 針對同時加入多種試劑組分，加樣后在混勻器上充分混勻。注意穩(wěn)拿穩(wěn)放，防止外濺。 | |
| 酶標(biāo)儀測定重復(fù)性差 | 校準(zhǔn)酶標(biāo)儀。 | |
| 孵育時間、洗滌條件、顯色條件、操作人員不一致 | 重復(fù)測定標(biāo)本，反應(yīng)條件、人員等盡可能與上次保持一致。 | |
| 洗滌不正確 | 移液器準(zhǔn)確加入200μl/孔洗滌液或注滿各孔，但不要溢出。洗板機(jī)洗板時不應(yīng)有堵孔，洗滌應(yīng)充分。 | |
| 孵育溫度恒溫效果不好 | 保證溫度恒定，避免局部溫度過高過低。 | |
| 加液時，過多殘留于孔壁上 | 加液時，吸頭在不碰到孔底的前提下盡量沿著孔壁下方加液。 | |
| 耗材重復(fù)使用 | 吸取不同的試劑時應(yīng)更換吸頭，配置不同的試劑組分時，應(yīng)使用不同的儲液器皿。 | |
| 微孔底部被劃傷或存在污垢 | 操作時細(xì)心，注意不要觸碰底部。擦拭酶標(biāo)板底部，以去除污垢或指紋。 | |
| 閾值附近時陰時陽 | 同一樣品做3個復(fù)孔，以2個（含2個以上相同結(jié)果為準(zhǔn)）。 | |
| 加樣時交叉污染 | 加標(biāo)本時盡量避免交叉污染。 | |
| 出現(xiàn)隨機(jī)性的花板、跳孔現(xiàn)象 | 手工洗板造成的交叉污染 | 手工洗板時前 3次注洗液后應(yīng)立即棄去，后幾次再設(shè)定浸泡時間，可減少交叉污染。 |
| 拍板時交叉污染 | 拍板時用合適的吸水紙巾，不要把無關(guān)物質(zhì)拍進(jìn)板孔，并盡量不要在同一位置拍，以免交叉污染。 | |
| 洗板機(jī)加液頭堵塞導(dǎo)致加液不滿或吸液殘留量較大，造成花板、跳孔 | 疏通加液頭，使洗板時每孔均注滿洗液，吸液時殘留量要小。 | |
| 樣本離心處理不全，致使反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血現(xiàn)象或存在沉淀物或殘留細(xì)胞成分干擾 | 血清血漿應(yīng)充分離心，3000rpm 6min以上。 | |
| 樣品放置時間過長，污染 | 樣品應(yīng)保持新鮮，或低溫保存，防止污染。 | |
| 洗滌液配制有誤或直接誤用濃縮洗滌液 | 按說明書配制。 |
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